如何通過共聚焦顯微鏡觀察96孔板？

如何通過共聚焦顯微鏡觀察96孔板？

一般共聚焦顯微鏡專用物鏡的焦距都很短，只有10倍物鏡的焦距可以直接透過96孔板的底部看到細胞。如果你想用更高倍數的物鏡觀察，必須使用特殊的96孔板，或者特殊的長工作距離物鏡。我見別人用過一種底部是0.17mm厚度玻璃的96孔板，這個可以向幾個細胞培養耗材生產商問問，長工作距離的物鏡可以向共聚焦顯微鏡的生產商問，一般這個就比較貴了。

CRISPR-Cas9基因編輯6--挑單克隆技術哪家強

挑選到滿意的sgRNA之后，就要開始正式實驗，而正式實驗中細胞轉染部分我則不會再講，直接到最關鍵的部分：挑取單克隆。

（1）Day 0: 質粒轉染

還是同之前一樣，將sgRNA-pSpCas9質粒轉入到目的細胞中，此時根據可根據細胞不同，選用不同的轉染試劑或轉染方法。

（2）Day 2/3: 篩選

根據使用的Cas9骨架質粒的不同，篩選的方式也不同：

在這里我選擇方法（2）

（3）挑取單克隆

篩選過后的細胞則按照1個/孔的密度種到96孔板中，放在Incucyte之類活細胞工作站監控，每天拍2-3張全孔掃描照片，7天后查看96孔板單克隆生長狀況，反查第1天時的照片，確認是單細胞即可。以下是Incucyte的結果示例（因為連續視頻有點大，因此放上day1和day10的圖）：

（4）Day 10（根據不同的細胞，選擇不同培養時間）

將挑中的單克隆消化后接種到24孔板中擴大培養等待后續驗證。

（5）沒有可全孔掃描拍照的儀器怎么辦

Incucyte是挑單克隆的利器，可全孔掃描的儀器也可使用，由于可以追蹤到最早期的細胞個數，因此能確認細胞克隆是來自于單細胞。但Incucyte之類的儀器并不是所有平臺都有，此時只能用老方法進行單克隆細胞挑?。?/p>

試過之后，覺得方法（3）容易實現一些，可如下圖所示：

對于轉染難度低且皮實的細胞來說，挑取單克隆可以說是在我這個CRISPR-Cas9敲除方案中最難的一個實驗，非常之關鍵。