如何檢測WB實驗中的蛋白質表達？

WB實驗是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質樣品分離后，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原。

與相對應的第一抗體特異性結合，之后再與酶或同位素標記的第二抗體相結合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達的蛋白成分。

蛋白質樣品制備

原始樣品可為細胞、組織、培養上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。

1.培養細胞或藥物處理。

2.棄培養基，用1X PBS漂洗細胞2次，去盡殘留培養基。

3.加入1X SDS樣品緩沖液，刮落細胞，轉移到Ep管。注意：冰上操作。

4.超聲10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。

5.煮沸樣品5min。

6.離心12000g，5min，取上清。

SDS-PAGE電泳

一、清洗玻璃板

二、灌膠與上樣

1. 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。

2. 配 10％ 分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml槍吸取5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。

3. 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水肢掘弊吸干。

4. 配 4％ 的濃縮膠, 加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

5. 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。

6. 在電泳槽的上、下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS電泳緩沖液，上樣。

7. 連接電泳槽到電泳歷族儀。上槽接負極,下槽接正極，通電起始電壓70～ 80V，10min后100V，電泳2h或當溴酚藍遷移至離底部1cm時，停止電泳。

轉膜

1. 將膠浸于轉移緩沖液中平衡 10min。注意：若檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。

2. 依據膠的大小剪取膜和濾紙6 片， 放入轉移緩沖液中平衡10min。如用PVDF 膜需用純甲醇浸泡飽和 3-5 秒鐘。

3. 裝配轉移三明治:海綿3層濾紙膠膜，3層濾紙海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記:膠放于負極面(黑色面)。

4. 將轉移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面對黑色面)，加轉移緩沖液， 插上電極，100V，1h(電流約為 0.3A)。

5. 轉膜結束后，切斷電源，取出雜交膜。

封閉與雜交

1.用25ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動。

2.置膜于25ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動。

3.15mlTBS/T洗3次(5min/T)。

4.加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4°C過夜，緩慢搖動。

5.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。

6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動。

7.15ml TBS/T洗3次(5min/T)。

8.15ml TBS洗1次。5

顯色

將 A、B 發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于 A、B 混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min 左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。

取出膠片立即完全浸入顯影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。

WB 中常見的問題以及處理辦法。

一、信號強度低

信號強度低是指在正常曝光條件下得到的目的條帶微小或是沒有目的條帶，而增加曝光時間又會招致背景高、雜帶多等問題。掃除試劑質量、操作失誤等方面的影響，這一類問題產散塌生的主要緣由如下：

① 樣本蛋白表達量缺乏。倡議添加蛋白表達量較高的細胞系作為陽性對照，或是恰當增加上樣量以取得較高程度的信號；

② 蛋白質降解。在蛋白樣品制備期間留意蛋白酶抑止劑 PMSF 的運用，所制備的樣品盡快檢測或妥善保管；

③ 蛋白的轉膜。運用恰當孔徑的膜，同時優化轉膜時間，關于高分子量蛋白可能需求更長的轉膜時間。

④ 抗體的運用?？贵w的反響種屬與實驗類型需求可以滿足實驗的需求，此外，抗體的稀釋比、孵育時間等問題也需求在實驗中不時優化；

⑤ 蛋白與抗體分離率低。減少洗膜次數或縮短洗膜時間，降低洗膜液中 NaCl 濃度等；

⑥ 抗原被封鎖液遮蓋。換用不同的封鎖液，優化封鎖液中蛋白質濃度并縮短封鎖時間；

⑦ 甲醇濃渡過高。會招致蛋白質與 SDS 別離，并沉淀在凝膠中，同時使凝膠收縮或變硬，從而抑止高分子量蛋白的轉移。實驗中可恰當降低甲醇濃度或者運用乙醇、異丙醇替代。

二、非特異性條帶或條帶位置不對

WB 結果中目的條帶之外的條帶被稱為非特異性條帶，有時非特異性條帶很明顯，卻沒有目的條帶，這些狀況對結果剖析會產生很大的干擾。普通來說惹起這類問題的主要要素有：

① 抗體的非特異性分離。通常以為，多抗的特異性不如單抗，更容易產生非特異性條帶，而恰當降低抗體的濃度有助于減少雜帶。同時為了掃除二抗非特異性分離的可能，倡議設二抗陰性對照；

② 樣品蛋白量過高。恰當降低上樣量，同時延長洗濯時間與封鎖時間可防止蛋白量過高對實驗結果的不良影響；

③ 蛋白質降解。會招致條帶位置變化并產生更多雜帶，倡議采用新穎制備的或是凍融次數較少的樣品；

④ 細胞傳代次數過多。會招致蛋白表達形式的分化，倡議運用原始或傳代少的細胞株；

⑤ 蛋白存在復合物。有的目的蛋白會和其他蛋白分離構成復合物，招致條帶位置改動，需求查閱相關文獻來肯定蛋白能否會構成穩定復合物；

⑥ 蛋白存在剪接體或多種修飾方式。局部蛋白存在剪切位點，有的剪切體具有免疫活性，在 WB 中也會被檢測出。此外有的目的蛋白會存在糖基化位點或其他修飾位點，條帶大小可能會遠超理論分子量。因而需求查閱文獻或是 uniprot 來得知蛋白的剪切體大小以及修飾位點等。

三、背景過高

在局部 WB 結果中，條帶之外本應是空白的背景也會有較深的顏色，對剖析結果會產生干擾，而且結果圖不美觀，難以用于文章發表。這種問題的可能緣由有以下幾點：

① 封鎖不充沛。背景過高的主要緣由之一是封鎖有問題，倡議運用適宜的封鎖劑（脫脂奶粉、BSA 等），優化反響濃度與封鎖時間，同時留意防止呈現抗體與封鎖劑的穿插反響，以及封鎖劑與含有目的抗原，內源性生物素或者與抗生物素蛋白/鏈霉親和素不相溶等問題；

② 洗膜不充沛。恰當增加洗膜次數弛緩沖液體積，進步吐溫20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的問題；

③ 抗體的運用。一抗濃渡過高是高背景的緣由之一，且二抗也存在與封鎖劑非特異性分離的可能，因而倡議恰當優化一抗濃度，并設二抗陰性對照；

④ 曝光時間長。倡議在實驗中采用適宜的曝光時間。

四、條帶彌散或外形怪異

有時 WB 結果圖中條帶位置契合預期，但卻由于條帶彌散、外形怪異等要素招致無法運用，呈現這種狀況多半是制膠或電泳過程出了問題，詳細如下：

① 電泳時電壓、電流過高。會招致條帶遷移速率過快以及 SDS-PAGE 溫度升高，并可能使得條帶彌散、外形變形。倡議運用適宜的電泳條件并堅持低溫；

② 電極不均衡。會招致條帶偏斜，上樣時在無樣品的膠孔中參加等量樣品緩沖液可防止這種狀況；

③ 上樣量過高，樣品中鹽離子濃度較大。上樣量過高可能會招致條帶彌散，樣品中的鹽離子濃度不分歧則會招致條帶不齊等問題。因而在上樣時需保證樣品量分歧且恰當，并堅持相同的、較低的鹽離子濃度。

④ 制膠問題。在配膠時一定要保證充沛混勻，平均凝膠，上樣前用針頭將膠孔撥正并吹出膠孔中的氣泡。

⑤ 電泳緩沖液寄存過久。電泳實驗中的緩沖液假如放置過久也會對結果有不良影響，因而倡議及時改換新的緩沖液。

五、膜上分布不平均的污點

有時在 WB 做出結果后，除了目的條帶以外，膜上還散布著不規律的污點，對結果也會有較大的干擾。這類問題產生的主要緣由有以下幾點：

① 試劑、儀器等污染。倡議在每次實驗前后留意清算實驗儀器，同時及時改換呈現問題的試劑；

② 轉膜時有氣泡。確保在轉膜過程中將氣泡掃除潔凈；

③ 抗體孵育時與膜接觸不充沛。確保在抗體孵育過程中，液體總量足夠，同時將抗體平均配置，并在搖擺的條件下停止孵育；

④ 曝光時間。過度曝光會招致斑點更明顯，倡議采用適宜的曝光時間；

⑤ 膜枯燥。實驗中要保證有充沛的反響液，防止呈現干膜現象。