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熒光定量PCR測定拷貝數，通過ct來計算，拷貝數一般與ct成線性關系 不用熒光定量PCR，用分光光度計法怎么計算呢？quiller2000(站內聯系TA)分光光度法測拷貝數？這個還真不知道呢houcaixia(站內聯系TA)有一種超微量的分光光度計，是用來測DNA，RNA，蛋白等的純度和含量，只需要0.2ul，就可以測出里面DNA含量（ng級的），你可以試一下。不過需要先提取質粒，也可以測出你質粒的純度。 有一種超微量的分光光度計，是用來測DNA，RNA，蛋白等的純度和含量，只需要0.2ul，就可以測出里面DNA含量（ng級的），你可以試一下。不過需要先提取質粒，也可以測出你質粒的純度。 Last edited by houcaix ... 你這個是測濃度啊 你這個是測濃度啊 你這個是測濃度啊 怎么測拷貝數呢？ 好像確實是這個問題啊，你可以先測一下菌液濃度，換算為1ml含有多少菌體（可以用細胞計數板），提取1ml菌液的質粒，然后測一下質粒濃度，一般情況下應該知道質粒的大小，然后計算一下，應該就可以計算出質粒的拷貝數了吧？不過好像有點麻煩，嘿嘿houcaixia(站內聯系TA)Originally posted by 微毛蟲 at 21 同問~~~~~~:( 好像確實是這個問題啊，你可以先測一下菌液濃度，換算為1ml含有多少菌體（可以用細胞計數板），提取1ml菌液的質粒，然后測一下質粒濃度，一般情況下應該知道質粒的大小，然后計算一下，應該就可以計算出質粒的拷貝數了吧？不過好像有點麻煩，嘿嘿微毛蟲(站內聯系TA)Originally posted by houcaixia at 10

植物基因工程實驗技術-提取質粒

EP管是一種小型的離心管,又稱為EP(eppendorf)管?？梢耘c微型離心機配套使用,用于微量試劑的分離 微量離心管離心。

rpm（離心機的轉速單位，轉rpm，以下簡寫為r）

提取大腸桿菌中的質粒

查看預約離心機，相應抗生素LB液體要有，管子要有滅好的

搖菌不能超16h

低拷貝數質粒的純化

從過夜培養的菌液中純化得到的低拷貝質粒的得率大約為 0.1-1 μg/mL，若要提取中低拷貝數的質粒 DNA，請遵循以困旁念下準則：

培養體積：使用高拷貝質粒菌培養基的 2 倍體積。

使用 2 倍體積的 Buffer A1，B1，N1，這些緩沖液可單獨向 Biomiga 購買。

使用與高拷貝質粒菌相同體積的 DNA Wash Buffer、Buffer KB

1.提前準備

預約離心機，打開金屬浴設定60℃，將EB/ddH2O預熱，

拿大盤子準備：槍（1000 & 100）、槍頭（大 & 中）、離心管（2ml&1.5ml提幾個拿幾個）、剪成條條的濾紙、配平用的水+管子、計時器、質粒提取試劑盒

2.簡要步驟

搖菌，1-5%，勿超16h。

12000r 1min，收菌。棄廢液，濾紙吸除干凈，

check始終一邊放管子，使得菌物沉淀到一邊，否則沉淀物若沉到另一邊的話，已沉淀的那邊容易被帶跑。

冰箱拿+250ul A1 槍吹打，拒絕渦旋、拒絕氣泡 ，加完放冰箱

+250ul B1 <5min 輕轉10次

+350ul N1 輕轉10次，關鍵是混合均勻

12000r 10min

槍移液至柱子 12000r 1min 棄廢液-掛質粒

+500ul KB 12000r 1min 棄廢液-洗蛋白

+500ul DNAbuffer 12000r 1min 棄廢液-洗雜

重復+500ul DNAbuffer 12000r 1min 棄廢液-洗雜

開蓋空轉 12000r 2min

將柱子轉移到干凈1.5ml中，加30ul EB 靜置1min后12000r 1min

3.安全注意事項

EB致癌物

4.可能出現的現象

下面步驟來自實驗室的試劑盒，不同試劑盒步驟不一樣。質粒DNA的提取方法主要有堿裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法，該試劑盒使用的是堿裂解法（說明書 ）。此方法適用于小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：

1. 接種新鮮的單個菌落到 1-5 mL LB 培養基（含適量抗生素）， 37℃震蕩培養 14-16 h。 注：不建議培養時間超過 16 h，可能會導致大腸桿菌裂解從而降低質粒 產量。大腸桿菌分大搖小搖，挑單的菌需先小搖后大搖

或接 1%-5% 含質粒的大腸桿菌細胞液體于 LB培養基。

Q如果搖菌時間過長，會出現什么問題？細菌死亡還是？？？

A可能導致菌裂解，這樣會降低產量，不能超16h。

注：請勿從凍存的甘油菌直接培養。

注：此步驟適用于 LB 培養的大腸桿菌，當使用 TB 或者 2xYT 培養基時， 需要特別注意 OD600不要超過 3.0。當使用了過量的培養基，對應的 Buffer 的體積需要對應增加。

2. 12,000 rpm 離心 1 min，棄上清，將管子倒置于紙巾上，去除 殘留培養基。 注：殘留的液體培養基容易導致菌體裂解不完全，從而降低產量。

3. 加入 250 μL Buffer A1 (使用前加入 RNase A)，用移液器或渦 旋震蕩儀充分懸浮細菌細胞。 注：充分重懸有利于菌體裂解和中和。

緩沖液A1是堿性的，有滲透壓，容易使細胞裂解，緩沖液B1使得細胞裂掉、變透明，緩沖液N1是酸性的，啟慶將溶液給中和過來的，誘導蛋白質沉淀將最后提取出來的質粒測濃度時，加EB的溶液要用EB作為空白參照物來測，加水的溶液要用水作為空白參照物來測汪困。

4. 加入 250 μL Buffer B1，輕輕地反轉 10 次以混勻（不要渦旋）， 室溫靜置 5 min。 注：靜置時間不要超過 5 min，時間過長會導致基因組污染或質粒損傷。 注：Buffer B1 低于室溫會結晶，使用前在 37℃預熱 Buffer B1 使沉淀溶 解。

5. 加入 350 μL Buffer N1，立即反轉/振蕩 5-10 次以混勻。 注：冰上靜置 1 min 有助于提高得率。

6. 12,000 rpm 離心 10 min。 注：若裂解液不澄清，將管子轉一個角度，再離心 5 min，將澄清的裂 解液轉移至 Mini Column。

7. 小心將上清液轉移至 Mini Column（自帶 2 mL Collection Tube）中，避免吸到沉淀，12,000 rpm 離心 1 min，棄濾液，將 Mini Column 放回至 2 mL Collection Tube。

8. 可選：加入 500 μL Buffer KB，12,000 rpm 離心 1 min，棄濾 液，將 Mini Column 放回至 2 mL Collection Tube。 注：此步驟對于 end A+菌株例如 HB101，JM110，JM101 及其衍生菌株 是必要的，而對于 end A-菌株例如 DH5α和 TOP10 是不必要的。

9. 加入 500 μL DNA Wash Buffer (使用前按要求加入乙醇)， 12,000 rpm 離心 1 min，棄濾液。 可選：重復步驟 9。

10. 將 Mini Column 開蓋放回至 2 mL Collection Tube，12,000 rpm 離心 2 min。 注：殘留的乙醇可通過打開柱蓋離心的方式去除，乙醇是否去除干凈將 會影響最后的洗脫效率。

11. 將 Mini Column 轉移至一個干凈的 1.5 mL 離心管，在膜中 央加入 50-100 μL（>50 μL）Elution Buffer 或 ddH2O，靜置 1 min， 12,000 rpm 離心 1 min 洗脫質粒 DNA。

可選：將洗脫下來的液體重新上柱，二次洗脫。

注：第一次洗脫通常得到 70%左右的質粒。二次洗脫有利于回收剩下 20~30%的質粒 DNA。

注：純化得到的質粒 DNA 可直接用于下游實驗例如基因克隆、RFLP、 文庫篩選、體外翻譯、測序等。

注：若用于內毒素敏感細胞系、原代細胞的轉染及顯微注射，建議購買 PD1212。

12. DNA 濃度可通過以下方式計算，

DNA 濃度（μg/mL）=OD260nm×50×稀釋倍數